Подтверждение одной мутации секвенированием по Сэнгеру в Дусти

Показания к исследованию:

• подтверждение (валидация) результата проведённых ранее генетических исследований (например, полного секвенирования экзома, полного секвенирования генома, секвенирования отдельных генов, генотипирования на чипе);
• определение статуса носительства мутации: исследование позволяет установить, выступает ли человек носителем той же генетической мутации, которая уже была выявлена у кого-либо из его родственников.

Внимание!

1. Секвенирование по Сэнгеру позволяет подтвердить не все возможные мутации в силу ограничений методики. Перед назначением теста рекомендуется связаться с лабораторией и уточнить, применим ли метод для конкретной мутации, которую нужно подтвердить.
2. При заказе исследования необходимо предоставить точную информацию о мутации, которую требуется подтвердить (запись варианта с использованием номенклатуры HGVS).

Что такое секвенирование по Сэнгеру

Метод секвенирования ДНК, или метод обрыва цепи, был разработан английским учёным Фредериком Сэнгером в 1977 году. За своё открытие Сэнгер был удостоен Нобелевской премии по химии.

Секвенирование — это определение последовательности нуклеотидов в составе ДНК (молекулы, несущей генетическую информацию).

Нуклеотидами называют особые молекулы: аденин (A), гуанин (G), цитозин © и тимин (T). Они соединяются попарно — аденин с тимином (A — T), а цитозин с гуанином (С — G), — и эти пары многократно повторяются в определённой последовательности, напоминая ступеньки лестницы. Таким образом, цель секвенирования ДНК — выявить, в какой именно последовательности выстраиваются «буквы» A, G, C, T в исследуемой ДНК, или визуализировать «ступеньки».

Для этого Фредерик Сэнгер предложил использовать одну из цепей изучаемой ДНК как матрицу (шаблон). Во время исследования с помощью фермента ДНК-полимеразы для неё синтезируется подходящая вторая цепь нуклеотидов.

При этом реакция синтеза второй цепи ДНК происходит таким образом, что на определённом отрезке она перестаёт синтезироваться — «обрывается». А по тому «обломку» второй цепи, который получается в результате реакции, можно установить последнюю «букву» секвенируемого фрагмента ДНК.

Для чего используется метод секвенирования по Сэнгеру

Метод секвенирования по Сэнгеру позволяет прочитывать последовательности длиной до 1 000 пар нуклеотидов и обычно применяется для анализа небольших участков генома, например одного экзона (участка) гена или фрагмента экзона гена.

Благодаря своей точности, а также относительной простоте и дешевизне исследование считается золотым стандартом для валидации, то есть подтверждения, результатов других генетических тестов, выполненных более сложными и широкоформатными, но имеющими свои ограничения по точности методами (NGS, генотипирование на микрочипах и др.).

Так, если у пациента ранее были обнаружены патогенные генетические мутации, то «координаты» сомнительного участка (выявленной мутации) ДНК уже известны. А значит, возможно прицельно сопоставить ДНК пациента с эталоном и убедиться в корректности результата.

Информация, необходимая для исследования

Для того чтобы сдать анализ, следует предоставить детальную информацию о генетической мутации, которую нужно подтвердить или опровергнуть:

• название гена;
• транскрипт («рабочая копия» ДНК);
• нуклеотидная и аминокислотная замена (изменения в последовательности аминокислот и ДНК);
• позиция в геноме;
• вариант сборки генома (информация о расположении генов, по которым проводилась «сверка»);
• зиготность варианта (монозиготный или гетерозиготный).

После отладки тест-системы будут исследованы предоставленные образцы биоматериала.

Если клиент предоставит неполную информацию, лаборатория не сможет точно определить целевой участок генома. Провести исследование в этом случае будет невозможно.

Особенности выполнения исследования

Исследование выполняется за 45 календарных дней. В отдельных случаях может потребоваться дополнительно до 30 дней. Например, если информация от пациента поступает с опозданием или если требуется повторно изготовить индивидуальные праймеры (короткие фрагменты ДНК, необходимые для проведения анализа).

Подготовка к исследованию

Специальной подготовки не требуется.

Если за 3 месяца до анализа пациенту делали переливание крови или её продуктов, пересадку костного мозга, а также если он проходил лечение стволовыми клетками, при оформлении заказа об этом следует сообщить.

Информация, необходимая для исследования

Для того чтобы сдать анализ, следует предоставить детальную информацию о генетической мутации, которую нужно подтвердить или опровергнуть:

• название гена;
• транскрипт («рабочая копия» ДНК);
• нуклеотидная и аминокислотная замена (изменения в последовательности аминокислот и ДНК);
• позиция в геноме;
• вариант сборки генома (информация о расположении генов, по которым проводилась «сверка»);
• зиготность варианта (монозиготный или гетерозиготный).

После отладки тест-системы будут исследованы предоставленные образцы биоматериала.

Если клиент предоставит неполную информацию, лаборатория не сможет точно определить целевой участок генома. Провести исследование в этом случае будет невозможно.

Противопоказания и ограничения

Метод секвенирования по Сэнгеру имеет ряд ограничений для применения.

Ограничения метода и ситуации, когда анализ не проводится:

• сложные области генома, наличие псевдогенов (нефункционирующих генов). В таком случае необходимо предварительное согласование с лабораторией;
• крупные перестройки ДНК (протяжённые делеции — потеря участка хромосомы; дупликации — удвоение участка хромосомы);
• мутации с экспансией повторов (увеличение количества определённых нуклеотидных повторов в некоторых генах, которое приводит к развитию патологии);
• количественный анализ мозаицизма или степени гетероплазмии мтДНК: ситуации, когда в организме присутствует два и более клона клеток с разными генотипами в ядерном или митохондриальном геноме;
• тканеспецифичный дефект (некоторые мутации можно выявить только в определённой ткани; в случае если для исследования предоставлен образец другой ткани, исследование будет невалидным);
• недостаточная или ошибочная информация о расположении генетического варианта в геноме.